從生物體內取出組織或細胞，在體外(in vitro)模擬體內生理環境，在無菌、適當溫度和一定營養條件下，對這些組織或細胞進行孵育培養，使之保持一定的結構和功能，以便于我們觀察研究，這種方法就是細胞培養（cell culture）。有時細胞培養也稱為組織培養（tissue culture），二者可作為同義語使用。

細胞培養的工作始于20世紀初目前廣泛應用于生物學、醫學的各個領域，并且是各種細胞工程技術的基礎。哈里森（ Harrison，1907），因此被稱為”組織培養之父”

培養細胞的類型及其特點

體外培養細胞大多培養在瓶皿等容器中，根據它們是否能貼附在支持物上生長的特性，可分為貼附型和懸浮型兩大類。

1.貼附型：

大多數培養細胞均為貼附型，它們必須貼附在支持物表面生長，這類細胞在體內時各自具有其特殊的形態，但在體外培養時貼附于支持物后形態上表現單一化而失去體內原有的某些特征，多呈上皮樣或成纖維細胞樣。

正常貼附型細胞的特點：

①接觸抑制：正常貼附型細胞具有接觸抑制的特性，細胞相互接觸后可抑制細胞的運動，因此細胞不會相互重疊于其上面生長。
②密度抑制：細胞生長、匯合成片后，雖發生接觸抑制，但只要營養充分，仍可增殖分裂，但當細胞數量達到一定密度后，由于營養的枯竭和代謝物的影響，細胞分裂停止，稱為密度抑制。

腫瘤細胞的接觸抑制及密度抑制往往減弱或消失，因此細胞可向三維空間發展，導致細胞堆積，并可生長至較高的終末細胞密度。

2.懸浮型：

①少數細胞在培養時不貼附于支持物上，而以懸浮狀態生長，包括一些取自血、脾或骨髓的培養細胞，尤其是血液白細胞，以及一些腫瘤細胞。
②細胞懸浮生長時可以呈單個細胞或細小的細胞團，胞體為圓形。
③其優點是在培養液中生長，生存空間大，允許長時間生長，便于大量繁殖。

細胞培養步驟

在進行細胞培養時，我們常用的儀器設備有：

無菌室，超凈工作臺，三重純水蒸餾器，抽氣泵，壓力蒸氣消毒器，電熱恒溫培養箱，培養器具，CO2培養箱，恒溫水浴鍋，倒置顯微鏡，離心機，無菌過濾器，洗刷裝置，細胞計數板和電子細胞技術儀等等。

細胞培養的步驟過程，大致可分為以下幾個環節：

1.準備工作

準備工作對開展細胞培養異常重要，工作量也較大，應給予足夠的重視，推備工作中某一環節的疏忽可導致實驗失敗或無法進行。準備工作的內容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養箱及其他儀器的檢查與調試。

2.取材

在無菌環境下從機體取出某種組織細胞（視實驗目的而定），經過一定的處理（如消化分散細胞、分離等）后接入培養器血中，這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的首次培養稱為原代培養。

理論上講各種動物和人體內的所有組織都可以用于培養，實際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個體的組織容易培養，分化程度低的組織比分化高的容易培養，腫瘤組織比正常組織容易培養。取材后應立即處理，盡快培養，因故不能馬上培養時，可將組織塊切成黃豆般大的小塊，置4℃的培養液中保存。取組織時應嚴格保持無菌，同時也要避免接觸其他的有害物質。取病理組織和皮膚及消化道上皮細胞時容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。

3.培養

將取得的組織細胞接入培養瓶或培養板中的過程稱為培養。如系組織塊培養，則直接將組織塊接入培養器皿底部，幾個小時后組織塊可貼牢在底部，再加入培養基。如系細胞培養，一般應在接入培養器皿之前進行細胞計數，按要求以一定的量（以每毫升細胞數表示）接入培養器皿并直接加入培養基。細胞進入培養器皿后，立即放入培養箱中，使細胞盡早進入生長狀態。

正在培養中的細胞應每隔一定時間觀察一次，觀察的內容包括細胞是否生長良好，形態是否正常，有無污染，培養基的PH是否太酸或太堿（由酚紅指示劑指示），此外對培養溫度和CO2濃度也要定時檢查。

原代培養一般有一段潛伏期（數小時到數十天不等），在潛伏期細胞一般不分裂，但可貼壁和游走。過了潛伏期后細胞進入旺盛的分裂生長期。細胞長滿瓶底后要進行傳代培養，將一瓶中的細胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續培養。每傳代一次稱為”一代”。二倍體細胞一般只能傳幾十代，而轉化細胞系或細胞株則可無限地傳代下去。轉化細胞可能具有惡性性質，也可能僅有不死性（Immortality）而無惡性。

4.凍存及復蘇

為了保存細胞，特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株，要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度－196℃，將細胞收集至凍存管中加入含保護劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存于液氮中。在極低的溫度下，細胞保存的時間幾乎是無限的。復蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內迅速融解。然后將細胞轉入培養器皿中進行培養。

凍存過程中保護劑的選用、細胞密度、降溫速度及復蘇時溫度、融化速度等都對細胞活力有影響。

常識問題總結

1.如何選用特殊細胞系培養基？

培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，首選MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養是一個好的開始，各種目的無血清培養最好首選AIM V（12005）培養基（SFM）。

2.L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎？它在溶液中不穩定嗎？

L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。

3.GlutaMAX-I是什么？培養細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩定？

GlutaMAX-I二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。

GlutaMAX-I二肽非常穩定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。

4.什么培養基中可以省去加酚紅？

酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應，培養細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養基。

5.如何用臺盼蘭計數活細胞？

用無血清培養基把細胞懸液稀釋到200～2000個/毫升，在0.1毫升的細胞懸液中加入0.1毫升的0.4％的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數分鐘后，用血球計數板計數細胞。活細胞排斥臺盼蘭，因而染成藍色的細胞是死細胞。

6.如何消除組織培養的污染？

當重要的培養污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。

高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。

1. 在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞，稀釋到常規細胞傳代的濃度。
2. 分散細胞懸液到多孔培養板中，或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
3. 每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現空泡，匯合度下降和變圓。
4. 確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2～3代。
5. 在無抗生素的培養基中培養細胞一代。
6. 重復步驟4。
7. 在無抗生素的培養基中培養4～6代，確定污染是否以已被消除

7.培養基中丙酮酸鈉的作用是什么？

丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

8.目錄上說，Hank"s 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養箱。原因是什么？Hank"s 平衡鹽溶液(HBS)和Earle"s平衡鹽溶液(EBS)有什么本質的功能差別？

HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織，需要用Eagles液，。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。

9.二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？

二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養基中所有的二價離子。

案例：我試用SF900 II時，細胞生長良好，但是我的蛋白產物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時效果好。

如果目的蛋白是一個后期蛋白，它將與蛋白酶一起表達，這些蛋白酶將會作用于目的蛋白。在加有血清的培養基中，這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白，從而使目的蛋白產品保持完好。在無血清配方中，蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。為了避免這一問題，加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清（少于1％），讓血清給蛋白酶提供作用底物。

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